Metody čištění proteinů v biotechnologii

Důležitou součástí biotechnologického výzkumu je použití technik proteinového inženýrství k návrhu nebo úpravě proteinů. Tyto techniky čištění proteinů optimalizují vlastnosti proteinů pro specifické průmyslové aplikace.

Tyto techniky vyžadují, aby vědci izolovali a purifikovali sledované proteiny, aby bylo možné studovat jejich konformace a substrátové specificity. Vyžadující studii jsou také reakce s jinými ligandy (protein, který se váže na receptorový protein) a specifické enzymové aktivity.

Požadovaný stupeň čistoty proteinu závisí na zamýšleném konečném použití proteinu. Pro některé aplikace postačuje hrubý extrakt. Pro jiná použití, například v potravinách a léčivech, je vyžadována vysoká úroveň čistoty. Několik technik pro proteinové čištění se používají k dosažení požadované úrovně čistoty.

Každý krok čištění proteinu obvykle vede k určitému stupni ztráty produktu. Ideální strategie purifikace proteinu je tedy taková, ve které je nejvyšší úrovně purifikace dosaženo v několika málo krocích.

Výběr kroků, které se mají použít, závisí na velikosti, náboji, rozpustnosti a dalších vlastnostech cílového proteinu. Následující techniky jsou nejvhodnější pro purifikaci jednoho cytosolického proteinu.

Čištění cytosolických proteinových komplexů je složitější a obvykle vyžaduje použití různých metod.

Prvním krokem při čištění intracelulárních (uvnitř buněk) proteinů je příprava surového extraktu. Extrakt bude obsahovat komplexní směs všech proteinů z buněčné cytoplazmy a některé další makromolekuly, kofaktory a živiny.

Tento surový extrakt může být použit pro některé aplikace v biotechnologii. Pokud je však problém čistoty, je třeba dodržovat následné kroky čištění. Surové proteinové extrakty se připravují odstraněním buněčných zbytků generovaných buněčnou lýzou, čehož je dosaženo použitím chemických látek, enzymy, sonication nebo French Press.

Zbytky se odstraní odstředěním a získá se supernatant (kapalina nad pevným zbytkem). Surové přípravky extracelulárních proteinů (mimo buňku) lze získat prostým odstraněním buněk odstředěním.

Najisto biotechnologie v aplikacích existuje poptávka po termostabilních enzymech - enzymech, které mohou tolerovat vysoké teploty bez denaturace, při zachování vysoké specifické aktivity.

Organismy, které produkují žáruvzdorné proteiny, se někdy nazývají extremofily. Snadným přístupem k čištění proteinu odolného vůči teplu je denaturovat ostatní proteiny ve směsi zahřívání a poté ochlazení roztoku (čímž umožní termostabilnímu enzymu reformovat nebo znovu rozpustit, pokud nutné). Denaturované proteiny pak mohou být odstraněny centrifugací.

Moderní biotech Protokoly často využívají mnoho komerčně dostupných souprav nebo metod, které poskytují hotová řešení pro standardní postupy. Čištění proteinu se často provádí pomocí filtrů a připravených gelových filtračních kolon.

Postupujte podle pokynů dialyzační soupravy a přidejte správný objem správného roztoku a vyčkejte na specifikovaná doba, během níž se eluent (rozpouštědlo prochází kolonou) shromažďuje v čerstvém testu trubka.

Chromatografické metody mohou být použity za použití kolon s horní částí nebo automatizovaného HPLC zařízení. Separace pomocí HPLC může být provedena metodami reverzní fáze, iontoměniče nebo vylučování podle velikosti a vzorky detekovány pomocí diodového pole nebo laserové technologie.

V minulosti byl běžným druhým krokem čištění proteinu ze surového extraktu srážení v roztoku s vysokou osmotickou silou (tj. Solné roztoky). Srážení proteinů se obvykle provádí za použití síranu amonného jako soli. Nukleové kyseliny v surovém extraktu mohou být odstraněny vysrážením agregátů vytvořených se streptomycin sulfátem nebo protamin sulfátem.

Srážení solí obvykle nevede k vysoce purifikovanému proteinu, ale může napomoci při eliminaci některých nežádoucích proteinů ve směsi a koncentraci vzorku. Soli v roztoku se pak odstraní dialýzou přes porézní celulózovou trubici, filtraci nebo gelovou vylučovací chromatografii.

Různé proteiny se vysráží v různých koncentracích síranu amonného. Obecně se proteiny s vyšší molekulovou hmotností vysráží v nižších koncentracích síranu amonného.

Chromatografie na reverzní fázi (RPC) odděluje proteiny na základě jejich relativních hydrofobit (vyloučení nepolárních molekul z vody). Tato technika je vysoce selektivní, ale vyžaduje použití organických rozpouštědel.

Některé proteiny jsou permanentně denaturovány rozpouštědly a během RPC ztratí funkčnost. Proto se tato metoda nedoporučuje pro všechny aplikace, zejména pokud je nezbytné, aby si cílový protein zachoval aktivitu.

Iontoměničová chromatografie se týká separace proteinů na základě náboje. Kolony mohou být připraveny pro aniontovou nebo kationtovou výměnu. Aniontoměničové kolony obsahují stacionární fázi s kladným nábojem, který přitahuje negativně nabité proteiny.

Katexové kolony jsou reverzní, negativně nabité kuličky, které přitahují pozitivně nabité proteiny. Eluce (extrakce jednoho materiálu z jiného) cílového proteinu (proteinů) se provádí změnou pH v sloupec, což má za následek změnu nebo neutralizaci nabitých funkčních skupin každé z nich protein.

Chromatografie vylučovací podle velikosti (známá také jako gelová filtrace) odděluje větší proteiny od menších ty, protože větší molekuly cestují rychleji skrze zesítěný polymer v chromatografii sloupec. Velké proteiny se nevejdou do pórů polymeru, zatímco menší proteiny ano, a trvat déle, než projdou chromatografickou kolonou, méně přímou cestou.

Eluát (výsledek eluce) se shromažďuje do řady zkumavek oddělujících proteiny na základě doby eluce. Gelová filtrace je užitečným nástrojem pro koncentraci vzorku proteinu, protože cílový protein je shromažďován v menším elučním objemu, než byl původně přidán do kolony. Podobné filtrační techniky by mohly být použity během výroby bílkovin ve velkém měřítku, protože jsou nákladově efektivní.

Afinitní chromatografie je velmi užitečná technika pro „leštění“ nebo dokončení procesu čištění proteinu. Kuličky v chromatografické koloně jsou zesítěny k ligandům, které se vážou specificky k cílovému proteinu.

Protein se potom odstraní z kolony opláchnutím roztokem obsahujícím volné ligandy. Tato metoda poskytuje nejčistší výsledky a nejvyšší specifickou aktivitu ve srovnání s jinými technikami.

SDS-PAGE (dodecylsulfát sodný používaný při elektroforéze na polyakrylamidovém gelu) se váže na proteiny a dává jim velký čistý záporný náboj. Protože náboje všech proteinů jsou celkem stejné, tato metoda je odděluje téměř úplně na základě velikosti.

SDS-PAGE se často používá k testování čistoty proteinu po každém kroku v sérii. Protože se nežádoucí proteiny postupně odstraňují ze směsi, počet pruhů vizualizovaných na gelu SDS-PAGE se snižuje, dokud není pouze jeden pruh představující požadovaný protein.

Imunoblotting je technika vizualizace proteinů použitá v kombinaci s afinitní chromatografií. Protilátky pro specifický protein se používají jako ligandy na afinitní chromatografické koloně.

Cílový protein je zadržen na koloně a poté odstraněn promytím kolony solným roztokem nebo jinými činidly. Protilátky spojené s radioaktivními nebo barvivovými značkami pomáhají při detekci cílového proteinu, jakmile je oddělen od zbytku směsi.