Restrikční endonukleázy jsou třídou enzym které řezají molekuly DNA. Každý enzym rozpoznává jedinečné sekvence nukleotidů v řetězci DNA - obvykle asi čtyři až šest párů bází. Sekvence jsou palindromické v tom, že komplementární řetězec DNA má stejnou sekvenci v opačném směru. Jinými slovy, oba řetězce DNA jsou vyříznuty na stejném místě.
Kde jsou tyto enzymy nalezeny
Restrikční enzymy se nacházejí v mnoha různých kmenech bakterií, kde jejich biologickou úlohou je účastnit se buněčné obrany. Tyto enzymy omezují cizí (virovou) DNA, která vstupuje do buněk jejich ničením. Hostitelské buňky mají restrikční modifikační systém, který methyluje vlastní DNA v místech specifických pro jejich příslušné restrikční enzymy, čímž je chrání před štěpením. Více než 800 známé enzymy byly objeveny, které rozpoznávají více než 100 různých nukleotidových sekvencí.
Typy restrikčních enzymů
Existuje pět různých typů restrikčních enzymů. Typ I štěpí DNA v náhodných místech až 1 000 nebo více párů bází z rozpoznávacího místa. Typ III řeže přibližně 25 párů bází od místa. Oba tyto typy vyžadují ATP a mohou to být velké enzymy s více podjednotkami. Enzymy typu II, které se používají převážně v biotechnologiích, rozřezávají DNA v rozpoznávané sekvenci bez potřeby ATP a jsou menší a jednodušší.
Restrikční enzymy typu II jsou pojmenovány podle bakteriálních druhů, ze kterých jsou izolovány. Například enzym EcoRI byl izolován z E. coli. Většina veřejnosti je obeznámena s E. ohniska coli v potravě.
Restrikční enzymy typu II mohou generovat dva různé typy řezů v závislosti na tom, zda štěpí oba vlákna ve středu rozpoznávací sekvence nebo každého vlákna blíže k jednomu konci rozpoznávání sekvence.
Předchozí řez vytvoří "tupé konce" bez nukleotidových přesahů. Ten generuje "lepkavé" nebo "kohezivní" konce, protože každý výsledný fragment DNA má přesah, který doplňuje ostatní fragmenty. Oba jsou užitečné v molekulární genetice pro výrobu rekombinantní DNA a proteiny. Tato forma DNA vyniká, protože je produkována ligací (spojením) dvou nebo více různých řetězců, které nebyly původně spojeny dohromady.
Enzymy typu IV rozpoznávají methylované DNA a enzymy typu V používají RNA ke štěpení sekvencí na napadajících organismech, které nejsou palindromické.
Použití v biotechnologii
Restrikční enzymy se v biotechnologii používají k rozštěpení DNA na menší řetězce, aby bylo možné studovat rozdíly délky fragmentů mezi jednotlivci. Toto se označuje jako polymorfismus délky restrikčních fragmentů (RFLP). Používají se také pro klonování genů.
Techniky RFLP byly použity k určení, že jednotlivci nebo skupiny jednotlivců mají výrazné rozdíly v genových sekvencích a vzory restrikčního štěpení v určitých oblastech genomu. Znalost těchto jedinečných oblastí je základem Otisky DNA. Každá z těchto metod závisí na použití elektroforéza na agarózovém gelu pro separaci fragmentů DNA. Pro agarózový gel se běžně používá pufr TBE, který se skládá z báze Tris, kyseliny borité a EDTA. elektroforéza zkoumat produkty DNA.
Použití v klonování
Klonování často vyžaduje vložení genu do plazmidu, což je typ kousku DNA. Restrikční enzymy mohou tomuto procesu pomoci, protože jednovláknové přesahy zanechávají při řezání. DNA ligáza, samostatný enzym, může spojit dvě molekuly DNA s odpovídajícími konci.
Takže použitím restrikčních enzymů s enzymy DNA ligázy mohou být k vytvoření jedné molekuly DNA použity kousky DNA z různých zdrojů.