Pufer TAE je roztok tvořený bází Tris, kyselinou octovou a EDTA (Tris-acetát-EDTA). Je to historicky nejběžnější pufr používaný pro agarózový gel elektroforéza v analýzách produktů DNA vznikajících z PCR zesílení, DNA purifikační protokoly nebo Klonování DNA experimenty.
Tento pufr má nízkou iontovou sílu a nízkou pufrovací kapacitu. Je nejvhodnější pro elektroforézu velkých (> 20 kilobáz) kusů DNA a bude nutné ji často vyměňovat nebo recirkulovat po delší dobu (> 4 hodiny). S ohledem na to můžete zvážit vytvoření několika šarží vyrovnávací paměti.
Vzhledem k tomu, že je pufr snadno vyrobitelný a kroky mohou být provedeny rychle, nemělo by být zpracování více než jedné dávky současně časově náročné nebo obtížné. Podle níže uvedených pokynů by mělo trvat až 30 minut, než se pufr TAE vytvoří.
Co potřebujete pro vyrovnávací paměť TAE
Protože vytváření vyrovnávací paměti TAE vyžaduje pouze rychlou a jednoduchou sadu pokynů, počet potřebných materiálů není příliš vysoký. Budete jen potřebovat disodnou sůl EDTA (kyselina ethylendiamintetraoctová), bázi Tris a ledovou kyselinu octovou.
Výroba pufru také vyžaduje pH metr a kalibrační standardy, podle potřeby. Budete také potřebovat kádinky nebo baňky s objemem 600 ml a 1 500 ml a odměrné válce. Nakonec budete potřebovat deionizovanou vodu, míchací tyče a míchací desky.
V následujících pokynech je hmotnost vzorce (atomová hmotnost každého prvku vynásobena počtem atomů, pak je hmotnost každého z nich sečtena) zkrácena na FW.
Připravte zásobní roztok EDTA
Řešení EDTA je připraveno předem. EDTA nepřejde úplně do roztoku, dokud není pH upraveno na asi 8,0. Pro zásobu 500 mililitrů roztok 0,5 M (molární nebo koncentrační) EDTA, odvážte 93,05 g disodné soli EDTA (FW = 372,2). Rozpusťte jej ve 400 mililitrech deionizované vody a upravte pH hydroxidem sodným (NaOH). Doplňte roztok na konečný objem 500 mililitrů.
Vytvořte své zásobní řešení
Připravte koncentrovaný (50x) zásobní roztok TAE navážením 242 gramů báze Tris (FW = 121,14) a rozpuštěním v přibližně 750 mililitrech deionizované vody. Opatrně přidejte 57,1 mililitrů ledové kyseliny a 100 mililitrů 0,5 M EDTA (pH 8,0).
Poté se roztok upraví na konečný objem 1 litr. Tento zásobní roztok lze skladovat při pokojové teplotě. PH tohoto pufru není upraveno a mělo by být asi 8,5.
Připravte pracovní řešení pufru TAE
Pracovní roztok 1x TAE pufru se připravuje jednoduchým zředěním zásobního roztoku 50x v deionizované vodě. Konečné koncentrace solutu jsou 40 mM (milimolární) Tris-acetát a 1 mM EDTA. Pufr je nyní připraven k použití při agarózovém gelu.
Zabalení
Než začnete, zkontrolujte inventář a ujistěte se, že máte všechny výše uvedené materiály pro pufr TAE. Váš zásobovací personál by vám měl být schopen sdělit, zda má na skladě všechny položky, které potřebujete. Nechcete skončit něco chybět uprostřed procedury.