Jak polymerázová řetězová reakce funguje k zesílení genů

polymerázová řetězová reakce (PCR) je molekulárně genetická technika pro vytváření více kopií genu a je také součástí procesu sekvenování genů.

Kopie genů se vytvářejí pomocí vzorku DNA a technologie je dostatečně dobrá na to, aby z jedné jediné kopie genu nalezeného ve vzorku vytvořila více kopií. PCR amplifikace genu za účelem vytvoření milionů kopií umožňuje detekci a identifikaci genových sekvencí pomocí vizuálních technik založených na velikosti a náboji (+ nebo -) části DNA.

Za kontrolovaných podmínek jsou malé segmenty DNA generovány enzymy známými jako DNA polymerázy, které přidávají doplňkové deoxynukleotidy. (dNTPs) na kus DNA známý jako „šablona“. Ještě menší kousky DNA, nazývané "primery", se používají jako výchozí bod pro polymeráza.

Primery jsou malé uměle vyrobené kousky DNA (oligomery), obvykle dlouhé 15 až 30 nukleotidů. Jsou vytvářeny znalostmi nebo hádáním krátkých sekvencí DNA na samotných koncích amplifikovaného genu. Během PCR se sekvenovaná DNA zahřeje a dvouřetězce se oddělí. Po ochlazení se primery navážou na templát (tzv. žíhání) a vytvoří místo pro začátek polymerázy.

Polymerázová řetězová reakce (PCR) byla umožněna objevem termofilních a termofilních polymerázové enzymy (enzymy, které udržují strukturální integritu a funkčnost po zahřátí na vysokou teploty). Kroky zahrnuté v technice PCR jsou následující:

• Vytvoří se směs s optimalizovanými koncentracemi templátu DNA, enzymu polymerázy, primerů a dNTP. Schopnost zahřívat směs bez denaturace enzymu umožňuje denaturaci dvoušroubovice vzorku DNA při teplotách v rozmezí 94 stupňů Celsia.
• Po denaturaci se vzorek ochladí na mírnější rozsah, kolem 54 stupňů, což usnadňuje nasedání (navázání) primerů na templáty jednovláknové DNA.
• Ve třetím kroku cyklu se vzorek znovu zahřeje na 72 stupňů, což je ideální teplota pro Taq DNA polymerázu, pro prodloužení. Během elongace využívá DNA polymeráza původní jedno vlákno DNA jako templát pro přidání komplementárních dNTP na 3' konce každého primeru a generují úsek dvouvláknové DNA v oblasti požadovaného genu.
• Primery, které nasedly na sekvence DNA, které nejsou přesnou shodou, nezůstanou nasedlé při 72 stupních, čímž se omezí prodloužení na požadovaný gen.

Tento proces denaturace, žíhání a elongace se opakuje vícekrát (30-40) krát, čímž se exponenciálně zvyšuje počet kopií požadovaného genu ve směsi. Ačkoli by byl tento proces při ručním provádění poměrně únavný, vzorky lze připravit a inkubovat v a programovatelný termocykler, nyní samozřejmostí ve většině molekulárních laboratoří, a lze v něm provést kompletní PCR reakci 3-4 hodiny.

Každý denaturační krok zastaví proces prodlužování předchozího cyklu, čímž se zkrátí nový řetězec DNA a zachová se přibližně na velikost požadovaného genu. Trvání elongačního cyklu lze prodloužit nebo zkrátit v závislosti na velikosti požadovaného genu, ale případně prostřednictvím opakovaných cyklů PCR bude většina templátů omezena na velikost samotného genu zájmu, protože budou vytvořeny z produktů obou primery.

Existuje několik různých faktory úspěšné PCR které lze manipulovat za účelem zlepšení výsledků. Nejrozšířenější metodou pro testování přítomnosti produktu PCR je elektroforéza na agarózovém gelu. Který se používá k oddělení fragmentů DNA na základě velikosti a náboje. Fragmenty jsou pak vizualizovány pomocí barviv nebo radioizotopů.

Od objevu PCR byly objeveny jiné DNA polymerázy než původní Taq. Některé z nich mají lepší schopnost „korektury“ nebo jsou stabilnější při vyšších teplotách, čímž zlepšují specifitu PCR a omezují chyby způsobené vložením nesprávného dNTP.

Některé varianty PCR byly navrženy pro specifické aplikace a nyní se pravidelně používají v molekulárně genetických laboratořích. Některé z nich jsou Real-Time PCR a Reverse-Transcriptase PCR. Objev PCR také vedl k vývoji sekvenování DNA, DNA otisky prstů a další molekulární techniky.