TBE pufr (Tris-borát-EDTA) je pufrový roztok tvořený bází Tris, kyselinou boritou a EDTA (kyselina ethylendiamintetraoctová). Tento pufr je často používán pro elektroforézu na agarózovém gelu při analýze produktů DNA, které jsou výsledkem amplifikace PCR, purifikačních protokolů DNA nebo klonovacích experimentů DNA.
Použití TBE
TBE pufr je zvláště užitečný pro separaci menších fragmentů DNA (MW <1000), jako jsou malé produkty restrikční enzym tráví. TBE má větší vyrovnávací kapacitu a dá ostřejší rozlišení než vyrovnávací paměť TAE. Pufr TAE (Tris-acetát-EDTA) je roztok tvořený bází Tris, kyselinou octovou a EDTA.
TBE je obecně dražší než TAE a inhibuje DNA ligázu, což může způsobit problémy, pokud jsou zamýšleny následné kroky purifikace a ligace DNA. Pomocí tří jednoduchých kroků, které následují, se naučte, jak vytvořit vyrovnávací paměť TBE. Vytvoření by nemělo trvat déle než 30 minut.
Co potřebuješ
K vytvoření TBE pufru budete potřebovat pouze čtyři látky. Zbývající položky v tomto seznamu jsou zařízení. Čtyři požadované látky jsou disodná sůl EDTA, báze Tris, kyselina boritá a deionizovaná voda.
Pokud jde o vybavení, budete potřebovat pH metr a kalibrační standardy podle potřeby. Kromě toho budete chtít mít kádinky nebo baňky o objemu 600 mililitrů a 1500 mililitrů. Zaokrouhlením vašich potřeb vybavení jsou odměrné válce, míchací tyče a míchací desky.
Než začnete, zkontrolujte inventář v laboratoři, kterou používáte, a ujistěte se, že máte vše, co potřebujete. Nic není horší, než kdybyste museli zastavit doprostřed přípravy řešení, protože vám došly správné materiály.
Pokud je vaše laboratoř ve škole nebo na pracovišti, ověřte si u správného personálu, zda mají všechny položky na skladě. Pokud tak učiníte, může vám nakonec ušetřit čas a energii.
Hmotnost vzorce je zkrácena na FW. Je to atomová hmotnost prvku vynásobená počtem atomů každého prvku ve vzorci, poté se sčítají všechny hmotnosti každého prvku dohromady.
Skladové řešení EDTA
Řešení EDTA by mělo být připraveno předem. EDTA nepřejde úplně do roztoku, dokud není pH upraveno na asi 8,0. Pro zásobní roztok o objemu 500 ml 0,5 M EDTA se naváží 93,05 g disodné soli EDTA (FW = 372,2). Poté se rozpustí ve 400 ml deionizované vody a pH se upraví pomocí NaOH (hydroxid sodný). Poté doplňte roztok na konečný objem 500 mililitrů.
Skladové řešení TBE
Připravte koncentrovaný (5x) zásobní roztok TBE vážením 54 gramů báze Tris (FW = 121,14) a 27,5 gramů kyseliny borité (FW = 61,83) a rozpuštění obou v přibližně 900 mililitrech deionizované voda. Poté se přidá 20 mililitrů 0,5 M (molárnost nebo koncentrace) EDTA (pH 8,0) a roztok se upraví na konečný objem 1 litr. Tento roztok může být skladován při pokojové teplotě, ale ve starších roztocích se vytvoří sraženina. Pufr skladujte ve skleněných lahvích a zlikvidujte, pokud se vytvoří sraženina.
Pracovní řešení TBE
Pro elektroforézu na agarózovém gelu lze použít pufr TBE v koncentraci 0,5x (ředění koncentrovaného zásobního roztoku 1:10). Zásobní roztok se zředí 10x deionizovanou vodou. Konečné koncentrace solutu jsou 45 mM Tris-boritan a 1 mM (milimolární) EDTA. Vyrovnávací paměť je nyní připravena k použití v provozování agarózového gelu.