Amplifikace DNA polymerázovou řetězovou reakcí

PCR znamená polymerázová řetězová reakce, technika molekulární biologie pro amplifikaci segmentů DNA generováním více kopií pomocí enzymů DNA polymerázy za kontrolovaných podmínek. Pouze jedna kopie segmentu DNA nebo genu může být klonována do milionů kopií, což umožňuje detekci pomocí barviv a dalších vizualizačních technik.

Proces PCR, který byl vyvinut v roce 1983, umožnil provedení DNA sekvenování a identifikovat pořadí nukleotidů v jednotlivých genech. Metoda používá termické cyklování nebo opakované zahřívání a chlazení reakce pro roztavení a replikaci DNA. Jak PCR pokračuje, „nová“ DNA se používá jako templát pro replikaci a následuje řetězová reakce, která exponenciálně amplifikuje templát DNA.

Techniky PCR se používají v mnoha oblastech biotechnologie včetně proteinové inženýrství, klonování, forenzní analýza (otisky prstů DNA), testování otcovství, diagnostika dědičných a / nebo infekčních chorob a analýza vzorků životního prostředí.

Zejména v forenzní praxi je PCR zvláště užitečná, protože zesiluje i nejmenší množství důkazů o DNA. PCR lze také použít k analýze DNA, která je stará tisíce let, a tyto techniky byly použity k identifikaci všeho od 800 000 let starého mamuta po mumie z celého světa.

Tento krok je nezbytný pouze pro DNA polymerázy, které vyžadují PCR s horkým startem. Reakční směs se zahřeje na teplotu mezi 94 a 96 ° C a udržuje se po dobu 1-9 minut.

Pokud postup nevyžaduje inicializaci, je prvním krokem denaturace. Reakční směs se zahřívá na 94 až 98 ° C po dobu 20 až 30 sekund. Vodíkové vazby šablony DNA jsou přerušeny a jsou vytvořeny jednovláknové molekuly DNA.

Reakční teplota je nižší mezi 50 a 65 ° C a udržuje se 20-40 sekund. Primery nasedají na jednovláknovou DNA templát. Během tohoto kroku je teplota nesmírně důležitá. Pokud je příliš horký, základní nátěr se nemusí vázat. Pokud je příliš chladno, může se základní nátěr nedokonale vázat. Dobrá vazba se vytvoří, když se sekvence primeru těsně shoduje se sekvencí templátu.

Teplota během tohoto kroku se mění v závislosti na typu polymerázy. DNA polymeráza syntetizuje zcela nový řetězec DNA.

Tento krok se provádí při 70 až 74 ° C po dobu 5 až 15 minut po posledním PCR cyklu.

Tento krok je volitelný. Teplota se udržuje na 4 až 15 ° C a reakce se stříká.

Během každého cyklu se produkt (specifická část DNA, která se replikuje) zdvojnásobí.

Jak DNA polymeráza ztrácí aktivitu a spotřebovává činidla, reakce zpomaluje.

Nehromadí se žádný další produkt.