Pole biotechnologie je jedna z neustálých změn. Rychlý růst a rozvoj špičkového výzkumu závisí na inovacích a kreativitě vědci a jejich schopnost vidět potenciál v základní molekulární technice a aplikovat jej na nové procesy. Nástup polymerázové řetězové reakce (PCR) otevřelo mnoho dveří v genetickém výzkumu, včetně prostředků DNA analýza a identifikace různých genů na základě jejich sekvencí DNA. Sekvenování DNA závisí také na naší schopnosti používat Gelová elektroforéza k oddělení řetězců DNA, které se liší velikostí až o jeden pár bází.
Sekvenování DNA
Na konci 70. let byly vynalezeny dvě techniky sekvenování DNA pro delší molekuly DNA: metoda Sanger (nebo dideoxy) a metoda Maxam-Gilbert (chemické štěpení). Metoda Maxam-Gilbert je založena na nukleotidově specifickém štěpení chemikáliemi a nejlépe se používá k sekvenování oligonukleotidů (krátké nukleotidové polymery, obvykle menší než 50 párů bází). Metoda Sanger se běžně používá, protože se ukázalo, že je technicky snáze použitelné, a příchod PCR a automatizace techniky se snadno aplikuje na dlouhé řetězce DNA včetně některých celých geny. Tato technika je založena na ukončení řetězce dideoxynukleotidy během PCR elongačních reakcí.
Sangerova metoda
V Sangerově metodě se vlákno DNA, které má být analyzováno, používá jako templát a DNA polymeráza se v reakci PCR používá k vytvoření komplementárních vláken pomocí primerů. Připraví se čtyři různé reakční směsi PCR, z nichž každá obsahuje určité procento analogů dideoxynukleosid trifosfátu (ddNTP) k jednomu ze čtyř nukleotidů (ATP, CTP, GTP nebo TTP).
Syntéza nového řetězce DNA pokračuje, dokud se nezačlení jeden z těchto analogů, kdy je vlákno předčasně zkráceno. Každá PCR reakce skončí obsahující směs různých délek DNA řetězců, všechny končící nukleotidem, který byl pro tuto reakci označen dideoxy. Gel elektroforéza se potom používá k oddělení řetězců čtyř reakcí ve čtyřech oddělených drahách a ke stanovení sekvence původního templátu na základě toho, jaké délky řetězců končí tím, co nukleotid.
V automatizované Sangerově reakci se používají primery, které jsou označeny čtyřmi různými barevnými fluorescenčními značkami. Reakce PCR v přítomnosti různých dideoxynukleotidů se provádějí, jak je popsáno výše. Poté se však čtyři reakční směsi spojí a nanesou na jediný pruh gelu. Barva každého fragmentu je detekována pomocí laserového paprsku a informace jsou shromažďovány počítačem který generuje chromatogramy ukazující píky pro každou barvu, z nichž může být sekvence templátové DNA odhodlaný.
Typicky je metoda automatizovaného sekvenování přesná pouze pro sekvence až do maximální délky asi 700-800 párů bází. Je však možné získat úplné sekvence větších genů a ve skutečnosti celých genomů pomocí postupných metod, jako je Primer Walking a Shotgun sekvenování.
V Primer Walking je funkční část většího genu sekvenována pomocí Sangerovy metody. Nové primery jsou generovány ze spolehlivého segmentu sekvence a použity k pokračování v sekvenování části genu, která byla mimo rozsah původních reakcí.
Sekvenování brokovnice znamená náhodné rozdělení požadovaného segmentu DNA na vhodnější (zvládnutelné) fragmenty velikosti, sekvencování každého fragmentu a uspořádání kusů na základě překrývání sekvence. Tato technika byla usnadněna aplikací počítačového softwaru pro uspořádání překrývajících se kusů.